初期:1915年-1940年
1915年,弗德里克· 特沃特(Frederick W.Twort)擔(dān)任倫敦布朗研究所所長。特沃特在研究中力圖尋找用于天花疫苗的痘苗病毒(vaccina virus)的變異株(variant),這種變異株可能在活細胞外介質(zhì)中復(fù)制。他在一項試驗中將一部分天花疫苗接種給一個含營養(yǎng)瓊脂的培養(yǎng)盤。雖然這種病毒未能復(fù)制,但是細菌污染物在瓊脂盤中生長很快。特沃特繼續(xù)進行他的培養(yǎng)并注意到,一些細菌菌落顯示出“帶水的樣子”(即變得比較透明)。這樣的菌落做進一步培養(yǎng)時也不再能復(fù)制(即細菌被殺死)。特沃特把這種現(xiàn)象稱為透明轉(zhuǎn)化(glassy transformation)。他接著證明用透明轉(zhuǎn)化原理感染一個正常的細菌菌落會把這種細菌殺死。這種透明實體很容易通過一個陶瓷過濾器,可被稀釋一百萬倍,當放在新鮮細菌上的時候就會恢復(fù)它的實力,或者說滴度。 特沃特發(fā)表了一篇描述這種現(xiàn)象的短文,認為對他所觀察的結(jié)果的解釋是存在一種細菌病毒。由于服役于第一次世界大戰(zhàn),特沃特的研究中斷了。返回倫敦后,他沒有繼續(xù)進行這項研究因此在這個領(lǐng)域沒有作出進一步的貢獻。 與此同時,加拿大醫(yī)學(xué)細菌學(xué)家費利克斯· 德赫雷爾(Felix d’Herelle)當時正在巴黎的巴斯德研究所工作。1915年8 月,法國的一個騎兵中隊駐扎在巴黎郊外的梅宗-勒菲特(Maisons-Lafitte),一場嚴重的志賀氏桿菌引發(fā)的痢疾對整個部隊造成了毀滅性的打擊。德赫雷爾對患者的糞便進行過濾,很快從過濾的乳狀液中分離出痢疾桿菌,并且加以培養(yǎng)。細菌不斷生長,復(fù)蓋了培養(yǎng)皿的表面。德赫雷爾偶然觀察到清楚的圓點,上面沒有長出任何細菌。他把這些東西稱為乳樣斑(taches vierges),或稱為噬斑(plaques)。德赫雷爾跟蹤觀察一名患者的整個感染過程,觀察何時細菌最多,斑點何時出現(xiàn)。有意思的是,患者的病情在感染后的第四天開始好轉(zhuǎn)。 德赫雷爾把這些病毒(virus)稱為噬菌體(bateriophage),緊接著他發(fā)明了病毒學(xué)研究領(lǐng)域的方法。他將噬斑進行有限的稀釋,測定病毒的濃度。他的推論是出現(xiàn)斑點表明病毒為顆粒或稱為小體(corpuscular)。德赫雷爾在研究中還證明病毒感染的第一步是病原體附著(吸附)宿主細胞。他通過把病毒與宿主細胞混合后共沉淀證明了這一點。(他還證明,上清中不存在這種病毒)一種病毒的附著只是在細菌對與它混合的病毒敏感時才出現(xiàn),這表明了一種病毒對宿主細胞的吸附有特定的范圍。他還用很清楚的現(xiàn)代術(shù)語描述了細胞溶菌(lysis)的釋放。德赫雷爾在許多方面是現(xiàn)代病毒學(xué)原理的創(chuàng)始人之一。 到1921 年,越來越多的溶原性菌株(lysogenic bacterial strain) 被分離,在一些實驗中已經(jīng)不可能把病毒與它的宿主分開。這使布魯塞爾巴斯德研究所的朱勒斯· 博爾德特(Jules Bordet)認為,德赫雷爾描述的傳染性病原體只不過是一種促進自身繁殖的細菌酶(bacterial enzyme)。雖然這是一種錯誤的結(jié)論,但是它相當接近于朊病毒(prion)結(jié)構(gòu)和復(fù)制的看法。 在20 世紀20-30 年代,德赫雷爾重點探索他的研究成果在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用,但是毫無成果。當時進行的基礎(chǔ)研究常常受該領(lǐng)域個別科學(xué)家的強烈個性所產(chǎn)生的解釋的影響。顯然有許多不同的噬菌體,一些為溶菌性(lytic)而另一些則是溶原性(lysogenic),但是它們之間的相互關(guān)系仍然定義不明確。這個時期的重要發(fā)現(xiàn)是馬克斯· 施萊辛格,他證明純化的噬菌體最大直徑(linear dimension)0.1 微米,質(zhì)量大約4x10克,它們由蛋白質(zhì)和DNA 構(gòu)成,比例大體上相等。1936 年那時沒有任何人清楚地知道如何利用這種觀察結(jié)果,但是,它在隨后的20 年里產(chǎn)生了重大影響。
現(xiàn)代:1938 年-1970 年
馬克斯· 德爾布呂克(Max Delbruck)是吉廷根大學(xué)(Gittinge)培養(yǎng)出來的物理學(xué)家。他的第一份工作是在柏林威廉化學(xué)研究所,在那里他與一些研究人員積極地討論量子物理與遺傳學(xué)的關(guān)系。德爾布呂克對這個領(lǐng)域的興趣使他發(fā)明了一種基因的量子機械模型(guantum mechanical model of gene)。1937 年,他申請并獲得了在加利福尼亞理工學(xué)院學(xué)習(xí)的獎學(xué)金。一到加利福尼亞理工學(xué)院他就開始與另一位研究員埃默里· 埃利斯(Emory Ellis)合作。埃利斯當時正在研究一組噬菌體-T2 、T4 、T6(T-偶數(shù)噬菌體)。德爾布呂克很快認識到這些病毒適合研究病毒復(fù)制。這些噬菌體是探索遺傳信息如何決定一種生物體的結(jié)構(gòu)和功能的一個途徑。從一開始,這些病毒就被視為了解癌癥病毒,甚至了解精子如何使卵子受精并發(fā)育為一種新生物體的典型系統(tǒng)。埃利克和德爾布呂克設(shè)計出一步生長曲線試驗。在這項試驗中,一種受感染的細菌經(jīng)過半個小時的潛伏期(latent period)或稱為隱蔽期(eclipse period)之后釋放了大量噬菌體。這項試驗給潛伏期下了定義,即病毒失去傳染性的時候。這成為這個噬菌體研究小組的試驗范例。 第二次世界大戰(zhàn)爆發(fā)后,德爾布呂克留在美國(在范德比爾特大學(xué)),見到了意大利難民薩爾瓦多·盧里亞(Salvador E . Luria)。盧里亞逃到美國避難,當時在紐約州哥倫比亞大學(xué)研究T1和T2噬菌體。他們是1940 年12 月28 日在費城舉行的一次會議上見面的,并在隨后的兩天里策劃在哥倫比亞大學(xué)的試驗。兩位科學(xué)家將招聘和領(lǐng)導(dǎo)越來越多的研究人員重點研究利用細菌病毒作為了解生命進程的一個模型。對他們的成功起關(guān)鍵作用的是1941 年夏天他們應(yīng)邀到冷泉港實驗室做試驗。就這樣一位德國物理學(xué)家和一位意大利遺傳學(xué)家在二戰(zhàn)期間一直進行合作,周游美國招聘新一代的生物學(xué)家,后來這些人被稱為噬菌體研究小組。 此后不久,新澤西州普林斯頓RCA 實驗室的電子顯微學(xué)家湯姆· 安德森(Tom Anderson)見到了德爾布呂克。到1942 年3 月,他們第一次獲得了噬菌體的清晰照片。大約同時,這些噬菌體變異株第一次被分離和鑒定。到1946 年,冷泉港實驗室開設(shè)了第一門噬菌體課程,1947 年3 月,第一次噬菌體會議有8 人出席。分子生物學(xué)就是從這些緩慢的開端中發(fā)展起來的。這門科學(xué)的重點是研究細菌宿主及其病毒。
隨后的25 年(1950 年至1975 年)是用噬菌體進行病毒學(xué)研究碩果累累的時期。數(shù)百名病毒學(xué)家發(fā)表了數(shù)千篇論文,主要涉及三個領(lǐng)域:(a)用T-偶數(shù)噬菌體進行的大腸桿菌溶菌性感染研究;(b)利用λ噬菌體進行的溶原性研究,以及(c)幾種獨特噬菌體的復(fù)制和特性研究,例如ФX174 (單鏈環(huán)狀DNA)、RNA 噬菌體、T7 等。它們?yōu)楝F(xiàn)代分子病毒學(xué)和生物學(xué)奠定了基礎(chǔ)。本文不可能一一介紹所有這些科學(xué)文獻,只能提及一些有選擇的重點。 到1947年至1948年,用生物化學(xué)方法研究噬菌體感染細胞在潛伏期發(fā)生的變化開始盛行。西摩·科恩(Seymour Cohen)最初曾在哥倫比亞大學(xué)與歐文· 查格夫(Erwin Chargaff)一道研究脂質(zhì)和核酸,隨后又與溫德爾· 斯坦利研究煙草花葉病毒RNA ,1946年在冷泉港實驗室主修德爾布呂克的噬菌體課程。他利用比色法(colorimetric analisis)研究被噬菌體感染的細胞中DNA 和RNA 水平的影響。
這些研究表明,被噬菌體感染的細胞中大分子合成發(fā)生了戲劇性的改變:(a)RNA 的凈積累在這些細胞中停止。[后來,這成為發(fā)現(xiàn)多種RNA 的基礎(chǔ),并且第一次證明了信使RNA 的存在]。(b)DNA 合成停止了7 分鐘,隨后又以5 倍至10 倍的速度恢復(fù)DNA 合成。(c)與此同時,蒙諾德(Monod)和沃爾曼(Wollman)的研究表明,噬菌體感染后一種細胞酶——可誘導(dǎo)β-半乳糖苷酶(galactosidase)的合成受到抑制。這些試驗把病毒的潛伏期分為初期(在DNA 合成之前)和晚期兩個階段。更重要的是這些研究結(jié)果表明,病毒可能改變受感染細胞的大分子合成過程。 到1952 年底,兩項試驗對這個領(lǐng)域產(chǎn)生了重要影響。
首先,赫爾希和蔡斯利用標記病毒蛋白(SO)和核酸(PO)跟蹤噬菌體對細菌的附著。他們能用攪拌機去除病毒的蛋白質(zhì)衣殼,只保留與受感染細胞有聯(lián)系的DNA 。這使他們能夠證明這種DNA 具有再生大量新病毒所需的全部信息。赫爾希-蔡斯的試驗和沃森與克里克一年后闡述的新DNA 結(jié)構(gòu)共同構(gòu)成了分子生物學(xué)革命的奠基石。 病毒學(xué)領(lǐng)域的第二項試驗是1953年由懷亞特(G.R.Wyatt)和科恩(S.S.Cohen)進行的。他們在研究T-偶數(shù)噬菌體時發(fā)現(xiàn)一個新的堿基,即5‘羥甲基胞嘧啶(hydroxymethylcytosine)。這個新發(fā)現(xiàn)的堿基似乎取代了細菌DNA 中的胞嘧啶(cytosine)。這使科學(xué)家們開始對細菌和受噬菌體感染的細胞中DNA 的合成進行了長達10 年的研究。最關(guān)鍵的研究表明,病毒把遺傳信息引入受感染的細胞中。到1964 年,馬修斯(Mathews)等人的研究證明,未受感染的細胞中不存在5‘羥甲基胞嘧啶,并且必須由病毒為之編碼。這些試驗提出了脫氧嘧啶(deoxypyrimidine)生物合成和DNA 復(fù)制方面的早期酶學(xué)概念,提供的明確的生物化學(xué)證據(jù)表明可以編碼一種新的信息并在受感染的細胞中表達。對這些噬菌體的詳細遺傳分析后確認了編碼這些噬菌體蛋白質(zhì)的基因,并繪制了基因圖使概念更完整。實際上,對T-偶數(shù)噬菌體的rⅡ 和B 順反子(cistron)的遺傳分析成為研究最充分的“遺傳精細結(jié)構(gòu)”之一。利用噬菌體變異株和提取物體外復(fù)制病毒DNA ,對我們當代了解DNA 如何自我復(fù)制作出了重要貢獻。最后,通過對噬菌體裝配的詳細遺傳學(xué)分析,利用噬菌體突變株體外裝配的互補性闡明了有機體如何利用自我裝配的原理構(gòu)建復(fù)雜結(jié)構(gòu)。對噬菌體溶菌酶的遺傳和生物化學(xué)分析有助于闡述突變的分子性質(zhì),噬菌體突變(琥珀突變)提供了在分子水平研究第二位點抑制突變(second-site suppressor mutation)的明確方式 。DNA的環(huán)形排列、末尾冗余(引起噬菌體雜合體)結(jié)構(gòu)可以解釋T 偶數(shù)噬菌體的環(huán)形遺傳圖。 病毒和細胞蛋白質(zhì)的合成在受噬菌體感染的細胞中發(fā)生明顯變化,這一點是在早期研究中使用十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gels)而被戲劇性地發(fā)現(xiàn),結(jié)果表明病毒蛋白質(zhì)的合成有特定順序,分為早期蛋白質(zhì)和晚期蛋白質(zhì)。這種一過性的基本調(diào)節(jié)機制最終發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)RNA 聚合酶和授予基因特殊性的∑因子。幾乎每一個級別的基因調(diào)節(jié)(轉(zhuǎn)錄、RNA 穩(wěn)定性、蛋白合成、蛋白處理)的研究均是通過對噬菌體感染性研究得出的原始數(shù)據(jù)揭示的。 雖然溶菌噬菌體(lytic phage)研究取得如此顯著的進展,但是仍然沒有人能清楚地解釋溶源性噬菌體(lysogenic phage)。這種局面在1949年發(fā)生了變化,當時,巴斯德研究所的安德烈·勒沃夫(Andre Lwoff) 開始對Bacillus megaterium 及其溶源性噬菌體進行研究。通過使用一種顯微操縱器將單一細菌分割多達19次,從未釋放出任何病毒。當從外部對溶源性細菌進行溶解時,也沒有發(fā)現(xiàn)病毒。但是經(jīng)常出現(xiàn)一個細菌自發(fā)地發(fā)生溶解并釋放出許多病毒來的現(xiàn)象。紫外線能誘使這些病毒釋放是一項重要的發(fā)現(xiàn),這種觀察可以概述一種病毒與其宿主之間的奇妙關(guān)系。到1954年,巴斯德研究所的雅各布(Jacob)和沃爾曼(Wollman)得出重要的研究結(jié)果,即一種溶源性菌株(Hfr ,λ)與非溶源性受體在結(jié)合之后的遺傳雜交(genetic cross)導(dǎo)致病毒的誘發(fā)。他們把這個過程稱為合子誘導(dǎo)(zygotic induction)。事實上溶源性噬菌體或稱原噬菌體(prophage)在其宿主大腸桿菌的染色體中的位置,可在遺傳雜交之后用標準的中斷交尾實驗繪圖。這是在概念上了解溶源性病毒的最關(guān)鍵試驗之一,理由如下:(a)病毒的行為就像一種細菌的染色體上的細菌基因一樣;(b)它表明病毒遺傳物質(zhì)由于負面的調(diào)節(jié)而在病毒中保持靜止的試驗結(jié)果之一。當染色體從溶源性供體細菌傳遞到非溶源性受體宿主時,該病毒遺傳物質(zhì)丟失;(c)這有助于解釋雅各布和沃爾曼早在1954 年就認識到的酶合成以及噬菌體生成的誘導(dǎo)是同一現(xiàn)象的表現(xiàn)”。這些試驗為操縱子模型(operon model)和協(xié)同基因調(diào)控(coordinate gene regulation)的性質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。 雖然在1953年闡述了DNA的結(jié)構(gòu),1954年描述了合子誘導(dǎo),但是溶源現(xiàn)象中細菌染色體與病毒染色體之間的關(guān)系仍被稱為附著部位(attachment site),當時也只能從這些角度考慮。后來,坎貝爾(Campbell)根據(jù)噬菌體標記的順序在整合狀態(tài)下不同于復(fù)制或生長狀態(tài)這一事實,提出DNA與細菌染色體進行λ整合的模型,至此,病毒與其宿主之間的真正密切關(guān)系才得到認識。這導(dǎo)致分離出λ噬菌體的負調(diào)節(jié)基因或稱抑制基因,這是對溶原菌免疫特性的清楚了解,也是對基因如何進行協(xié)同調(diào)節(jié)的早期范例之一。對λ噬菌體生命周期的遺傳分析是微生物遺傳學(xué)領(lǐng)域的重大學(xué)術(shù)探險。它值得所有分子病毒學(xué)和生物學(xué)學(xué)者進行詳細的研究。 諸如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)P22 這樣的溶源性噬菌體是一般性轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)的第一個例證,而λ噬菌體是特殊轉(zhuǎn)導(dǎo)的第一個例證。病毒可能攜帶細胞基因,并把這樣的基因從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞,這不僅提供了精確遺傳繪圖的一種方法,而且也是病毒學(xué)中的一個新概念。隨著細菌的遺傳因素被更詳細地研究,可以清楚地看出,從溶源性噬菌體研究發(fā)展到附加體(episome)、轉(zhuǎn)座子(transposon)、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子(retrotranspon)、插入元件(insertion element)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(retrovirus)、嗜肝DNA病毒(hepadnovirus)、類病毒(viroid)、擬病毒(virusoid,又稱類病毒viroid-like指一類包裹在植物病毒顆粒中的病毒,譯者注),以及朊病毒(prion)研究,這一切使得遺傳信息在病毒與其宿主之間的定義和分類的關(guān)系開始變得模糊不清。從噬菌體研究中得出的遺傳和生化概念使病毒學(xué)的進一步發(fā)展成為可能。溶菌和溶源性噬菌體研究的經(jīng)驗和教訓(xùn)常常隨著對動物病毒的研究而被人們重新學(xué)習(xí)和修改。