DNA復(fù)制（DNA雙鏈進(jìn)行的復(fù)制過(guò)程）
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DNA復(fù)制
DNA雙鏈進(jìn)行的復(fù)制過(guò)程
基本信息
| 中文名 | DNA復(fù)制 |
| 拉丁學(xué)名 | replication |
| 外文名 | DNA replication |
| 途徑 | 半保留復(fù)制 |
| 簡(jiǎn)寫 | DNA |
| 作用 | 生物遺傳的基礎(chǔ) |
| 載體 | 所有DNA為遺傳物質(zhì)的生物體 |
| 過(guò)程 | 引發(fā)、延伸、終止 |
收起
定義
DNA復(fù)制
DNA復(fù)制主要包括引發(fā)、延伸、終止三個(gè)階段。
簡(jiǎn)介
DNA復(fù)制是生物遺傳的基礎(chǔ)，是所有生物體中最基本的過(guò)程。而這一過(guò)程是半保留復(fù)制，是以最開(kāi)始的雙鏈分子中的一條作為模板進(jìn)行DNA復(fù)制，產(chǎn)生兩個(gè)完全一致的DNA分子。細(xì)胞水平的校正和糾錯(cuò)機(jī)制能確保非常精確地復(fù)制DNA的拷貝。DNA復(fù)制發(fā)生在基因組的特定位置也就是起始點(diǎn)，DNA分子在起始點(diǎn)形成復(fù)制叉開(kāi)始復(fù)制。
DNA復(fù)制從起始序列開(kāi)始單向或雙向進(jìn)行。合成DNA雙螺旋的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫信帕械?，其中一條鏈的起始端與另一條鏈的末尾端平行排列在一起，每一個(gè)復(fù)制叉只有一條鏈?zhǔn)前凑諒奈驳筋^的正確方向指導(dǎo)新鏈從頭到尾方向合成。根據(jù)這條指導(dǎo)鏈，DNA復(fù)制持續(xù)向前合成復(fù)制叉。
DNA復(fù)制不能沿滯后鏈進(jìn)行，也就是說(shuō)，從頭到尾的DNA鏈，直到已經(jīng)復(fù)制了足夠長(zhǎng)度的DNA分子，否則DNA復(fù)制不會(huì)繼續(xù)沿著模本鏈進(jìn)行復(fù)制，DNA復(fù)制于是從新合成復(fù)制叉處分開(kāi)。在復(fù)制過(guò)程中必須暫停并等待更多的親本DNA鏈片段，而此時(shí)整個(gè)長(zhǎng)度只是沿著開(kāi)始到結(jié)束方向前進(jìn)了一小段距離。
復(fù)制體
復(fù)制體是一個(gè)執(zhí)行DNA復(fù)制的復(fù)雜分子機(jī)器。它由大量的次級(jí)元件組成，每一個(gè)次級(jí)元件在復(fù)制的過(guò)程中都行使一個(gè)特殊的功能。解螺旋酶能切斷兩條DNA分子之間的氫鍵，從而在DNA合成前分開(kāi)兩條鏈。當(dāng)解螺旋酶解開(kāi)雙螺旋時(shí)，引導(dǎo)DNA其它區(qū)域的超螺旋體排列好。
旋轉(zhuǎn)酶的作用是解開(kāi)由解旋酶切斷DNA鏈產(chǎn)生的超螺旋化，解旋酶使DNA鏈旋轉(zhuǎn)并釋放超螺旋體，使它們重新加入到DNA鏈中。旋轉(zhuǎn)酶最常見(jiàn)于復(fù)制叉的上游，形成超螺旋的位置。
由于DNA聚合酶只能連接DNA鏈（不能開(kāi)始），所以由引物酶引導(dǎo)指導(dǎo)鏈進(jìn)行復(fù)制。引物酶將與模本鏈互補(bǔ)的RNA引物加到DNA鏈上開(kāi)始復(fù)制岡崎片段。
DNA合成酶Ⅲ由2個(gè)催化核心構(gòu)成，一個(gè)引導(dǎo)DNA鏈復(fù)制，一個(gè)間隔DNA鏈。但是DNA合成酶Ⅲ不能停留足夠時(shí)間，有效地復(fù)制姐妹鏈。于是包含3個(gè)亞基的二聚物β聚合物共同包裹住DNA鏈?zhǔn)?/span>DNA合成酶Ⅲ留在DNA鏈上，確保DNA聚合酶Ⅲ能在鏈上合成幾千個(gè)核酸而不是幾百個(gè)。
DNA合成酶Ⅰ將引物酶添加的RNA引物去掉，完成岡崎片段。而DNA合成酶Ⅰ的作用會(huì)使岡崎片段之間產(chǎn)生小的空白區(qū)域，這就需要連接酶將岡崎片段連接起來(lái)，最終兩個(gè)岡崎片段的末端以共價(jià)鍵結(jié)合。
單鏈結(jié)合蛋白綁定在暴露的堿基上竭力防止DNA鏈的不穩(wěn)定并保證單鏈DNA之間不會(huì)由氫鍵形成危險(xiǎn)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。DNA合成酶包含一個(gè)校對(duì)機(jī)制，通常指的是“外切核酸酶活性”，即將錯(cuò)誤添加的核酸去除掉。
起源
DNA的復(fù)制是對(duì)那些堅(jiān)持達(dá)爾文主義世界觀的的人們的一項(xiàng)基本挑戰(zhàn)。作為生物信息被復(fù)制并傳遞給后代的過(guò)程，這是一個(gè)對(duì)于細(xì)胞的自我復(fù)制過(guò)程必要的機(jī)制。細(xì)胞的自我復(fù)制對(duì)于任何選擇性的過(guò)程中都是必要的，比如自然選擇。因此，試圖用自然選擇來(lái)解釋這個(gè)機(jī)制巨大的復(fù)雜性需要人們先要假設(shè)他們想解釋的東西的客觀存在。由于其極為復(fù)雜的性質(zhì)，大多數(shù)生化學(xué)者先前認(rèn)為該系統(tǒng)產(chǎn)生，是在最后一個(gè)共同祖先的起源之前。此外，許多生化學(xué)家長(zhǎng)久以來(lái)一直把在所有生命中觀察到的DNA復(fù)制的功能性的相似當(dāng)作DNA復(fù)制的單一的起源。不過(guò)在1999年，美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院的研究人員證明，參與細(xì)菌和古細(xì)菌或真核細(xì)胞（生命進(jìn)化之樹(shù)的兩個(gè)主干）的DNA復(fù)制的核心酶其實(shí)并沒(méi)有一個(gè)共同的進(jìn)化起源。因此，它看起來(lái)好像細(xì)菌和古細(xì)菌獨(dú)自產(chǎn)生了兩個(gè)相同的DNA復(fù)制系統(tǒng) — 在這兩個(gè)進(jìn)化的譜系據(jù)信分化自最后的共同祖先之后。
復(fù)制引發(fā)
復(fù)制的引發(fā)（Priming)階段包括DNA復(fù)制起點(diǎn)雙鏈被DNA解旋酶解開(kāi)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活步驟合成RNA分子；RNA引物的
DNA復(fù)制
為什么需要有RNA引物來(lái)引發(fā)DNA復(fù)制呢？這可能盡量減少DNA復(fù)制起始處的突變有關(guān)。DNA復(fù)制開(kāi)始處的幾個(gè)核苷酸最容易出現(xiàn)差錯(cuò)，因此，用RNA引物即使出現(xiàn)差錯(cuò)最后也要被DNA聚合酶Ⅰ切除，提高了DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性。RNA引物形成后，由DNA聚合酶Ⅲ催化將第一個(gè)脫氧核苷酸按堿基互補(bǔ)原則加在RNA引物3'-OH端而進(jìn)入DNA鏈的延伸階段。
過(guò)程
DNA雙螺旋的解旋
DNA在復(fù)制的時(shí)候，在DNA解旋酶的作用下，雙鏈?zhǔn)紫冉忾_(kāi)，形成了復(fù)制叉，而復(fù)制叉的形成則是由多種蛋白質(zhì)和酶參與的較復(fù)雜的復(fù)制過(guò)程
（1）單鏈DNA結(jié)合蛋白（single—stranded DNA binding protein,ssbDNA蛋白）
ssbDNA蛋白是較牢固結(jié)合在單鏈DNA上的蛋白質(zhì)。原核生物ssbDNA蛋白和DNA結(jié)合時(shí)表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)：如果第一個(gè)ssbDNA蛋白結(jié)合到DNA上去能力為1，第二個(gè)的結(jié)合能力可高達(dá)103；真核生物細(xì)胞里的ssbDNA蛋白與單鏈DNA結(jié)合時(shí)則不表現(xiàn)上述效應(yīng)。ssbDNA蛋白作用是保證解旋酶解開(kāi)的單鏈在復(fù)制完成前能保持單鏈結(jié)構(gòu)，以四聚體的形式存在于復(fù)制叉處，等待單鏈復(fù)制后才脫下來(lái)，重新循環(huán)。因此，ssbDNA蛋白僅保持單鏈的存在，是不起解旋作用。
（2）DNA解鏈酶（DNA helicase）
DNA解鏈酶可以通過(guò)水解ATP獲得能量以解開(kāi)雙鏈DNA。這一種解鏈酶分解ATP的活性依賴于單鏈DNA的存在。若雙鏈DNA中有單鏈末端或切口，則DNA解鏈酶能首先結(jié)合在這一部分，然后逐步向雙鏈的方向移動(dòng)。復(fù)制時(shí)，大部分DNA解旋酶沿滯后模板的5’—〉3’方向并隨著復(fù)制叉的前進(jìn)而移動(dòng)，只有個(gè)別解旋酶（Rep蛋白）是沿著3’—〉5’方向移動(dòng)。因而推測(cè)Rep蛋白和特定DNA解鏈酶是分別在DNA的兩條母鏈上協(xié)同作用以解開(kāi)雙鏈DNA。
（3）DNA解鏈過(guò)程
DNA在復(fù)制前不僅為雙螺旋而且處于超螺旋狀態(tài)，而超螺旋狀態(tài)的存在為解鏈前的必須結(jié)構(gòu)狀態(tài)，參與解鏈的除解鏈酶外有一些特定蛋白質(zhì)，比如大腸桿菌中的Dna蛋白等。一旦DNA局部雙鏈被解開(kāi)，就必須有ssbDNA蛋白以穩(wěn)定解開(kāi)單鏈，保證此局部不會(huì)恢復(fù)為雙鏈。兩條單鏈DNA復(fù)制的引發(fā)過(guò)程是有所差異，可是不論是前導(dǎo)鏈還是后隨鏈，都需要一段RNA引物用于開(kāi)始子鏈DNA合成。因此前導(dǎo)鏈和后隨鏈的差別在于前者從復(fù)制起始點(diǎn)開(kāi)始按5’—3’持續(xù)的合成下去、不形成岡崎片段、后者則隨著復(fù)制叉的出現(xiàn)、不斷合成長(zhǎng)約2—3kb的岡崎片段。
岡崎片段與半不連續(xù)復(fù)制
因?yàn)镈NA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，所以在?fù)制叉附近解開(kāi)的DNA鏈，一條為5’—〉3’方向，另一條為3’—〉5’方向，兩個(gè)模板極性是不同。所有已知DNA聚合酶合成方向均為5’—〉3’方向，不為3’—〉5’方向，所以無(wú)法解釋DNA的兩條鏈同時(shí)進(jìn)行復(fù)制的問(wèn)題。解釋DNA兩條鏈各自模板合成子鏈等速?gòu)?fù)制現(xiàn)象，日本的學(xué)者岡崎（Okazaki）等人提出了DNA的半不連續(xù)復(fù)制（semidiscontinuous replication）模型。在1968年，岡崎用3H脫氧胸苷短時(shí)間標(biāo)記大腸桿菌，提取DNA，變性之后用超離心方法得到了許多3H標(biāo)記的，被后人稱作為岡崎片段的DNA。延長(zhǎng)標(biāo)記時(shí)間之后，岡崎片段可轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腄NA鏈，所以這些片段必然是復(fù)制過(guò)程中的中間產(chǎn)物。另一個(gè)實(shí)驗(yàn)也證明DNA復(fù)制過(guò)程里首先合成較小的片段，即用DNA連接酶溫度敏感突變株進(jìn)行的試驗(yàn)，在連接酶不起作用的溫度中，便產(chǎn)生大量小DNA片段積累，表明DNA復(fù)制過(guò)程里至少有一條鏈?zhǔn)紫群铣奢^短的片段，之后再由連接酶鏈成大分子DNA。一般說(shuō)，原核生物的岡崎片段比真核生物長(zhǎng)。深入研究還可證明，前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制與滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制在生物界具有普遍性，故稱為DNA雙螺旋的半不連續(xù)復(fù)制。
端粒和端粒酶
在1941年，美籍印度人麥克林托克（Mc Clintock）就提出端粒（telomere)的假說(shuō)，指出染色體末端必然存在一種特殊結(jié)構(gòu)——端粒。已知染色體端粒的作用至少有2：a.保護(hù)染色體末端免受損傷，使染色體保持穩(wěn)定；b. 與核纖層相連，使染色體得以定位。
弄清楚DNA復(fù)制過(guò)程之后，在20世紀(jì)70年代，科學(xué)家對(duì)DNA復(fù)制時(shí)新鏈5’端的RNA引物被切除之后，空缺為如何被填補(bǔ)的提出了質(zhì)疑。如果不填補(bǔ)豈不是DNA每復(fù)制一次就短一點(diǎn)。后隨鏈復(fù)制為例，RNA引物被切除后，岡崎片段之間是由DNA聚合酶I催化合成的DNA填補(bǔ)之，然后再由DNA連接酶將它們連接成了一條完整的鏈。可是DNA聚合酶I催化合成DNA時(shí)，需要自由3’—OH作為其引物，最后余下子鏈的5’則無(wú)法填補(bǔ)，于是染色體就短一點(diǎn)。
在正常體細(xì)胞里普遍存在著染色體酶復(fù)制一次端粒就短一次的現(xiàn)象。推測(cè)，可能一旦端?？s短至某一閾限長(zhǎng)度一下時(shí)，就會(huì)發(fā)出一個(gè)警報(bào)，指令細(xì)胞進(jìn)入到衰老；或許為當(dāng)細(xì)胞判斷出它們的染色體已變得太短了，所以是分裂也就停止了，造成了正常體細(xì)胞壽命有一定界限?？墒窃?/span>癌細(xì)胞中染色體端粒卻一直維持在一定長(zhǎng)度上，這是為什么，這是因?yàn)镈NA復(fù)制之后，將染色體末端短缺部分補(bǔ)上需要端粒酶，是一種含有RNA的酶，其既解決了模板，又解決引物的問(wèn)題。在生殖細(xì)胞與85%癌細(xì)胞中都測(cè)出了端粒酶具有活性，可是在正常體細(xì)胞中卻無(wú)活性，20世紀(jì)90年代中期Blackburn首次在原生動(dòng)物中克隆出端粒酶基因。
端粒酶在癌細(xì)胞里具有活性，不僅使癌細(xì)胞可以不斷分裂增生，且為癌變前的細(xì)胞或已經(jīng)是癌性的細(xì)胞提供了時(shí)間，積累附加的突變，即等于增加了它們復(fù)制，侵入與最終轉(zhuǎn)移的能力。同時(shí)人們也由此萌生開(kāi)發(fā)以端粒為靶的藥物，即通過(guò)抑制癌細(xì)胞里端粒酶活性而達(dá)到治療癌癥的目的。
至于真核細(xì)胞DNA末端結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，早就在1978年，Blackburn就以原生動(dòng)物四膜出（一種纖毛蟲(chóng)）為例說(shuō)明之：a.迥紋形式的發(fā)夾環(huán)；b.僅由C,A組成的簡(jiǎn)單序列大量重復(fù)（C4A2）20~70；c.鏈上有許多缺口（nicks）
復(fù)制條件
酶和蛋白質(zhì) | 作用 |
幫助解開(kāi)復(fù)制叉前后的超螺旋結(jié)構(gòu) | |
DNA解旋酶 | 解開(kāi)螺旋 |
Rep蛋白 | 幫助解開(kāi)雙螺旋結(jié)構(gòu) |
引物合成酶 | 催化RNA引物合成并與DNA鏈互補(bǔ)的反應(yīng) |
單鏈結(jié)合蛋白 | 穩(wěn)定單連區(qū) |
展開(kāi)表格
鏈的延伸
DNA新生鏈的合成由DNA聚合酶Ⅲ所催化，然而，DNA必須由螺旋酶在復(fù)制叉處邊移動(dòng)邊解開(kāi)雙鏈。這樣就產(chǎn)生了一種拓?fù)鋵W(xué)上的問(wèn)題：由于DNA的解鏈，在DNA雙鏈區(qū)勢(shì)必產(chǎn)生正超螺旋，在環(huán)狀DNA中更為明顯，當(dāng)達(dá)到一定程度后就會(huì)造成復(fù)制叉難再繼續(xù)前進(jìn)，從而終
DNA復(fù)制
在DNA復(fù)制叉處要能由兩套DNA聚合酶Ⅲ在同一時(shí)間分別進(jìn)行復(fù)制DNA前導(dǎo)鏈和滯后鏈。如果滯后鏈模板環(huán)繞DNA聚合酶Ⅲ全酶，并通過(guò)DNA聚合酶Ⅲ，然后再折向與未解鏈的雙鏈DNA在同一方向上，則滯后鏈的合成可以和前導(dǎo)鏈的合成在同一方向上進(jìn)行。
這樣，當(dāng)DNA聚合酶Ⅲ沿著滯后鏈模板移動(dòng)時(shí)，由特異的引物酶催化合成的RNA引物即可以由DNA聚合酶Ⅲ所延伸。當(dāng)合成的DNA鏈到達(dá)前一次合成的岡崎片段的位置時(shí)，滯后鏈模板及剛合成的岡崎片斷便從DNA聚合酶Ⅲ上釋放出來(lái)。這時(shí)，由于復(fù)制叉繼續(xù)向前運(yùn)動(dòng)，便產(chǎn)生了又一段單鏈的滯后鏈模板，它重新環(huán)繞DNA聚合酶Ⅲ全酶，并通過(guò)DNA聚合酶Ⅲ開(kāi)始合成新的滯后鏈岡崎片段。通過(guò)這樣的機(jī)制，前導(dǎo)鏈的合成不會(huì)超過(guò)滯后鏈太多（最后只有一個(gè)岡崎片段的長(zhǎng)度）。而且，這樣引發(fā)體在DNA鏈上和DNA聚合酶Ⅲ以同一速度移動(dòng)。
多種DNA聚合酶在DNA復(fù)制過(guò)程中扮演不同的角色。在大腸桿菌中，DNA Pol III是主要負(fù)責(zé)DNA復(fù)制的聚合酶。它在復(fù)制分支上組裝成復(fù)制復(fù)合體，具有極高的持續(xù)性，在整個(gè)復(fù)制周期中保持完整。相反，DNA Pol I是負(fù)責(zé)用DNA替換RNA引物的酶。 DNA Pol I除了具有聚合酶活性外，還具有5'至3'外切核酸酶活性，并利用其外切核酸酶活性降解RNA引物。 Pol I在DNA復(fù)制中的主要功能是創(chuàng)建許多短DNA片段，而不是產(chǎn)生非常長(zhǎng)的片段。在真核生物中，Pol α有助于啟動(dòng)復(fù)制，因?yàn)樗c引物酶形成復(fù)合物。Pol ε和Pol δ負(fù)責(zé)前導(dǎo)鏈的合成。Pol δ還負(fù)責(zé)引物的去除，而Pol ε也參與復(fù)制期間DNA的修復(fù)
按上述DNA復(fù)制的機(jī)制，在復(fù)制叉附近，形成了以兩套DNA聚合酶Ⅲ全酶分子、引發(fā)體和螺旋構(gòu)成的類似核糖體大小的復(fù)合體，稱為DNA復(fù)制體(replisome)。復(fù)制體在DNA前導(dǎo)鏈模板和滯后鏈模板上移動(dòng)時(shí)便合成了連續(xù)的DNA前導(dǎo)鏈和由許多岡崎片段組成的滯后鏈。在DNA合成延伸過(guò)程中主要是DNA聚合酶Ⅲ的作用。當(dāng)岡崎片段形成后，DNA聚合酶Ⅰ通過(guò)其5'→3'外切酶活性切除岡崎片段上的RNA引物，同時(shí)，利用后一個(gè)岡崎片段作為引物由5'→3'合成DNA。最后兩個(gè)岡崎片段由DNA連接酶將其接起來(lái)，形成完整的DNA滯后鏈。
終止
DNA復(fù)制
才終止其DNA復(fù)制。但最近的實(shí)驗(yàn)表明，在DNA上也存在著復(fù)制終止位點(diǎn)，DNA復(fù)制將在復(fù)制終止位點(diǎn)處終止，并不一定等全部DNA合成完畢。但對(duì)復(fù)制終止位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和功能了解甚少。在DNA復(fù)制終止階段令人困惑的一個(gè)問(wèn)題是，線性DNA分子兩端是如何完成其復(fù)制的？已知DNA復(fù)制都要有RNA引物參與。當(dāng)RNA引物被切除后，中間所遺留的間隙由DNA聚合Ⅰ所填充。但是，在線性分子的兩端以5'→3'為模板的滯后鏈的合成，其末端的RNA引物被切除后是無(wú)法被DNA聚合酶所填充的。
在研究T7DNA復(fù)制時(shí)，這個(gè)問(wèn)題部分地得到了解決。T7DNA兩端的DNA序列區(qū)有160bp長(zhǎng)的序列完全相同。而且，在T7DNA復(fù)制時(shí)，產(chǎn)生的子代DNA分子不是一個(gè)單位T7DNA長(zhǎng)度，而是許多單位長(zhǎng)度的T7DNA首尾連接在一起。T7DNA兩個(gè)子代DNA分子都會(huì)有一個(gè)3'端單鏈尾巴，兩個(gè)子代DNA的3'端尾巴以互補(bǔ)結(jié)合形成兩個(gè)單位T7DNA的線性連接。然后由DNA聚合酶Ⅰ填充和DNA連接酶連接后，繼續(xù)復(fù)制便形成四個(gè)單位長(zhǎng)度的T7DNA分子。這樣復(fù)制下去，便可形成多個(gè)單位長(zhǎng)度的T7DNA分子。這樣的T7DNA分子可以被特異的內(nèi)切酶切開(kāi)，用DNA聚合酶填充與親代DNA完全一樣的雙鏈T7DNA分子。
DNA復(fù)制
真核生物在染色體的多個(gè)點(diǎn)開(kāi)始DNA復(fù)制，因此復(fù)制叉在染色體的許多點(diǎn)處相遇并終止。由于真核生物具有線性染色體，DNA復(fù)制無(wú)法到達(dá)染色體的最末端。由于這個(gè)問(wèn)題，在染色體末端的DNA在每個(gè)復(fù)制周期中都會(huì)丟失。端粒是接近末端的重復(fù)DNA區(qū)域，有助于防止基因丟失。端粒縮短是體細(xì)胞中的正常過(guò)程，它縮短了子DNA染色體的端粒。因此，在DNA丟失阻止進(jìn)一步分裂之前，細(xì)胞只能分裂一定次數(shù)。在生殖細(xì)胞中，端粒酶延伸端粒區(qū)域的重復(fù)序列以防止降解。
DNA復(fù)制的終止發(fā)生在特定的基因位點(diǎn)，即復(fù)制終止位點(diǎn)。該位點(diǎn)的終止位點(diǎn)序列被與該序列結(jié)合的阻止DNA復(fù)制的蛋白質(zhì)識(shí)別并結(jié)合，阻止了復(fù)制叉前進(jìn)，復(fù)制終止。細(xì)菌物的DNA復(fù)制末端位點(diǎn)結(jié)合蛋白又稱Ter蛋白。
因?yàn)榧?xì)菌具有環(huán)狀染色體，所以當(dāng)兩個(gè)復(fù)制叉在親本染色體的另一端彼此相遇時(shí)復(fù)制終止發(fā)生。大腸桿菌通過(guò)使用終止序列來(lái)調(diào)節(jié)該過(guò)程，當(dāng)該序列被Tus蛋白結(jié)合時(shí)，終止序列僅允許復(fù)制叉一個(gè)方向的通行。結(jié)果，復(fù)制叉總是在染色體的終止區(qū)域內(nèi)相遇，導(dǎo)致復(fù)制終止
在環(huán)狀DNA的復(fù)制的末端終止階段則不存在上述問(wèn)題。環(huán)狀DNA復(fù)制到最后，由DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ切開(kāi)雙鏈DNA，將兩個(gè)DNA分子分開(kāi)成為兩個(gè)完整的與親代DNA分子一樣的子代DNA。
DNA復(fù)制的特點(diǎn)
1．半保留復(fù)制：DNA在復(fù)制時(shí)，以親代DNA的每一股作模板，合成完全相同的兩個(gè)雙鏈子代DNA，每個(gè)子代DNA中都含有一股親代DNA鏈，這種現(xiàn)象稱為DNA的半保留復(fù)制。DNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，是在1958年由M. Meselson 和 F. Stahl 所完成的實(shí)驗(yàn)所證明。
2．有一定的復(fù)制起始點(diǎn)：DNA在復(fù)制時(shí)，需在特定的位點(diǎn)起始，這是一些具有特定核苷酸排列順序的片段，即復(fù)制起始點(diǎn)（復(fù)制子）。在原核生物中，復(fù)制起始點(diǎn)通常為一個(gè)，而在真核生物中則為多個(gè)。
3．需要引物（primer)：DNA聚合酶必須以一段具有3'端自由羥基（3'-OH）的RNA作為引物，才能開(kāi)始聚合子代DNA鏈。RNA引物的大小，在原核生物中通常為50～100個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為10個(gè)核苷酸。
5．半不連續(xù)復(fù)制：由于DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA鏈，因此兩條親代DNA鏈作為模板聚合子代DNA鏈時(shí)的方式是不同的。以3'→5'方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在聚合時(shí)基本上是連續(xù)進(jìn)行的，這一條鏈被稱為領(lǐng)頭鏈（leading strand)。而以5'→3'方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈在聚合時(shí)則是不連續(xù)的，這條鏈被稱為隨從鏈（lagging strand)。DNA在復(fù)制時(shí)，由隨從鏈所形成的一些子代DNA短鏈稱為岡崎片段（Okazaki fragment)。岡崎片段的大小，在原核生物中約為1000～2000個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為100個(gè)核苷酸。
相關(guān)說(shuō)明
DNA的復(fù)制是一個(gè)邊解旋邊復(fù)制的過(guò)程。復(fù)制開(kāi)始時(shí)，DNA分子首先利用細(xì)胞提供的能量，在解旋酶的作用下，把兩條螺旋的雙鏈解開(kāi)，這個(gè)過(guò)程叫解旋。然后，以解開(kāi)的每一段母鏈為模板，以周圍環(huán)境中的四種脫氧核苷酸為原料，按照堿基配對(duì)互補(bǔ)配對(duì)原則，在DNA聚合酶的作用下，各自合成與母鏈互補(bǔ)的一段子鏈。隨著解旋過(guò)程的進(jìn)行，新合成的子鏈也不斷地延伸，同時(shí)，每條子鏈與其母鏈盤繞成雙螺旋結(jié)構(gòu)，從而各形成一個(gè)新的DNA分子。這樣，復(fù)制結(jié)束后，一個(gè)DNA分子，通過(guò)細(xì)胞分裂分配到兩個(gè)子細(xì)胞中去！
注：復(fù)制時(shí)遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，復(fù)制發(fā)生在細(xì)胞分裂的間期。
DNA是遺傳信息的載體，故親代DNA必須以自身分子為模板準(zhǔn)確的復(fù)制成兩個(gè)拷貝，并分配到兩個(gè)子細(xì)胞中去，完成其遺傳信息載體的使命。而DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)對(duì)于維持這類遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性和復(fù)制的準(zhǔn)確性都是極為重要的。
（一）DNA的半保留復(fù)制
Waston和Click在提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型時(shí)曾就DNA復(fù)制過(guò)程進(jìn)行過(guò)研究，他們推測(cè)，DNA在復(fù)制過(guò)程中堿基間的氫鍵首先斷裂，雙螺旋解旋分開(kāi)，每條鏈分別作模板合成新鏈，每個(gè)子代DNA的一條鏈來(lái)自親代，另一條則是新合成的，故稱之為半保留式復(fù)制（semiconservative replication)。
1958年Meselson和Stahl進(jìn)行了如圖8-3-5的實(shí)驗(yàn)證明了DNA分子是以半保留方式進(jìn)行自我復(fù)制的。圖8-3-5 Meselson和Stahl證明DNA半保留復(fù)制的實(shí)驗(yàn)
（二）DNA復(fù)制的起始，方向和速度
DNA在復(fù)制時(shí)，雙鏈DNA解旋成兩股分別進(jìn)行。其復(fù)制過(guò)程的復(fù)制起點(diǎn)呈現(xiàn)叉子的形式，故稱復(fù)制叉。以復(fù)制叉向前移動(dòng)的方向?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)，一條模板鏈為3’—〉5’走向，在其上DNA能以5’—〉3’方向連續(xù)合成，稱為前導(dǎo)鏈（leading strand)；另一條模板鏈為5’—〉3’走向，在其上DNA也是5’—〉3’方向合成，但與復(fù)制叉移動(dòng)的方向正好相反，故隨著復(fù)制叉的移動(dòng)形成許多不連續(xù)的岡崎片段，最后在連成一條完整的DNA鏈，該鏈稱為后隨鏈（lagging strand)。實(shí)驗(yàn)證明DNA的復(fù)制是由一個(gè)固定的起始點(diǎn)開(kāi)始的。一般把生物體的單個(gè)復(fù)制單位稱為復(fù)制子。一個(gè)復(fù)制子只含一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。一般說(shuō)，細(xì)菌，病毒即線粒體DNA分子均作為單個(gè)復(fù)制子完成其復(fù)制，真核生物基因組可以同時(shí)在多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)上進(jìn)行雙向復(fù)制，即它們的基因組包括多個(gè)復(fù)制子。多方面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大多數(shù)生物內(nèi)DNA的復(fù)制都是從固定的起始點(diǎn)以雙向等速方式進(jìn)行的。復(fù)制叉以DNA分子上某一特定順序?yàn)槠鹗键c(diǎn)，向兩個(gè)方向等速生長(zhǎng)前進(jìn)。圖8-3-6 DNA復(fù)制過(guò)程
DNA復(fù)制過(guò)程
（三）DNA復(fù)制過(guò)程
以原核生物DNA復(fù)制過(guò)程予以簡(jiǎn)要說(shuō)明
1．DNA雙螺旋的解旋
DNA在復(fù)制時(shí)，其雙鏈?zhǔn)紫冉忾_(kāi)，形成復(fù)制叉，而復(fù)制叉的形成則是由多種蛋白質(zhì)及酶參與的較復(fù)雜的復(fù)制過(guò)程
ssbDNA蛋白是較牢固的結(jié)合在單鏈DNA上的蛋白質(zhì)。原核生物ssbDNA蛋白與DNA結(jié)合時(shí)表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)：若第1個(gè)ssbDNA蛋白結(jié)合到DNA上去能力為1，第2個(gè)的結(jié)合能力可高達(dá)103；真核生物細(xì)胞中的ssbDNA蛋白與單鏈DNA結(jié)合時(shí)則不表現(xiàn)上述效應(yīng)。ssbDNA蛋白的作用是保證解旋酶解開(kāi)的單鏈在復(fù)制完成前能保持單鏈結(jié)構(gòu)，它以四聚體的形式存在于復(fù)制叉處，待單鏈復(fù)制后才脫下來(lái)，重新循環(huán)。所以，ssbDNA蛋白只保持單鏈的存在，不起解旋作用。（2）DNA解鏈酶（DNA helicase） DNA解鏈酶能通過(guò)水解ATP獲得能量以解開(kāi)雙鏈DNA。這種解鏈酶分解ATP的活性依賴于單鏈DNA的存在。如果雙鏈DNA中有單鏈末端或切口，則DNA解鏈酶可以首先結(jié)合在這一部分，然后逐步向雙鏈方向移動(dòng)。復(fù)制時(shí)，大部分DNA解旋酶可沿滯后模板的5’—〉3’方向并隨著復(fù)制叉的前進(jìn)而移動(dòng)，只有個(gè)別解旋酶（Rep蛋白）是沿著3’—〉5’方向移動(dòng)的。故推測(cè)Rep蛋白和特定DNA解鏈酶是分別在DNA的兩條母鏈上協(xié)同作用以解開(kāi)雙鏈DNA。（3）DNA解鏈過(guò)程 DNA在復(fù)制前不僅是雙螺旋而且處于超螺旋狀態(tài)，而超螺旋狀態(tài)的存在是解鏈前的必須結(jié)構(gòu)狀態(tài)，參與解鏈的除解鏈酶外還有一些特定蛋白質(zhì)，如大腸桿菌中的Dna蛋白等。一旦DNA局部雙鏈解開(kāi)，就必須有ssbDNA蛋白以穩(wěn)定解開(kāi)的單鏈，保證此局部不會(huì)恢復(fù)成雙鏈。兩條單鏈DNA復(fù)制的引發(fā)過(guò)程有所差異，但是不論是前導(dǎo)鏈還是后隨鏈，都需要一段RNA引物用于開(kāi)始子鏈DNA的合成。因此前導(dǎo)鏈與后隨鏈的差別在于前者從復(fù)制起始點(diǎn)開(kāi)始按5’—3’持續(xù)的合成下去，不形成岡崎片段，后者則隨著復(fù)制叉的出現(xiàn)，不斷合成長(zhǎng)約2—3kb的岡崎片段。
2．岡崎片段與半不連續(xù)復(fù)制
因DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，故在?fù)制叉附近解開(kāi)的DNA鏈，一條是5’—〉3’方向，另一條是3’—〉5’方向，兩個(gè)模板極性不同。所有已知DNA聚合酶合成方向均是5’—〉3’方向，不是3’—〉5’方向，因而無(wú)法解釋DNA的兩條鏈同時(shí)進(jìn)行復(fù)制的問(wèn)題。為解釋DNA兩條鏈各自模板合成子鏈等速?gòu)?fù)制現(xiàn)象，日本學(xué)者岡崎（Okazaki）等人提出了DNA的半連續(xù)復(fù)制（semidiscontinuous replication）模型。1968年岡崎用3H脫氧胸苷短時(shí)間標(biāo)記大腸桿菌，提取DNA，變性后用超離心方法得到了許多3H標(biāo)記的，被后人稱作岡崎片段的DNA。延長(zhǎng)標(biāo)記時(shí)間后，岡崎片段可轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒霥NA鏈，因此這些片段必然是復(fù)制過(guò)程中的中間產(chǎn)物。另一個(gè)實(shí)驗(yàn)也證明DNA復(fù)制過(guò)程中首先合成較小的片段，即用DNA連接酶溫度敏感突變株進(jìn)行試驗(yàn)，在連接酶不起作用的溫度下，便有大量小DNA片段積累，表明DNA復(fù)制過(guò)程中至少有一條鏈?zhǔn)紫群铣奢^短的片段，然后再由連接酶鏈成大分子DNA。一般說(shuō)，原核生物的岡崎片段比真核生物的長(zhǎng)。深入研究還證明，前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制在生物界具有普遍性，故稱為DNA雙螺旋的半不連續(xù)復(fù)制。
3．復(fù)制的引發(fā)和終止
所有的DNA的復(fù)制都是從一個(gè)固定的起始點(diǎn)開(kāi)始的，而DNA聚合酶只能延長(zhǎng)已存在的DNA鏈，不能從頭合成DNA鏈，新DNA的復(fù)制是如何形成的？經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)研究證明，DNA復(fù)制時(shí)，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由聚合酶從RNA引物3’端開(kāi)始合成新的DNA鏈。對(duì)于前導(dǎo)鏈來(lái)說(shuō)，這一引發(fā)過(guò)程比較簡(jiǎn)單，只要有一段RNA引物，DNA聚合酶就能以此為起點(diǎn)，一直合成下去。對(duì)于后隨鏈，引發(fā)過(guò)程較為復(fù)雜，需要多種蛋白質(zhì)和酶參與。后隨鏈的引發(fā)過(guò)程由引發(fā)體來(lái)完成。引發(fā)體由6種蛋白質(zhì)構(gòu)成，預(yù)引體或引體前體把這6種蛋白質(zhì)結(jié)合在一起并和引發(fā)酶或引物過(guò)程酶進(jìn)一步組裝形成引發(fā)體。引發(fā)體似火車頭一樣在后隨鏈分叉的方向前進(jìn)，并在模板上斷斷續(xù)續(xù)的引發(fā)生成滯后鏈的引物RNA短鏈，再由DNA聚合酶 III 作用合成DNA，直至遇到下一個(gè)引物或?qū)槠螢橹埂Ｓ蒖NA酶H降解RNA引物并由DNA聚合酶 I 將缺口補(bǔ)齊，再由DNA連接酶將每?jī)蓚€(gè)岡崎片段連在一起形成大分子DNA.。
（四）端粒和端粒酶
1941年美籍印度人麥克林托克（Mc Clintock）就提出了端粒（telomere)的假說(shuō)，認(rèn)為染色體末端必然存在一種特殊結(jié)構(gòu)——端粒。已知染色體端粒的作用至少有二：① 保護(hù)染色體末端免受損傷，使染色體保持穩(wěn)定；② 與核纖層相連，使染色體得以定位。
在弄清楚DNA復(fù)制過(guò)程之后，20世紀(jì)70年代科學(xué)家對(duì)DNA復(fù)制時(shí)新鏈5’端的RNA引物被切除后，空缺是如何被填補(bǔ)的提出了質(zhì)疑。如不填補(bǔ)豈不是DNA每復(fù)制一次就短一點(diǎn)。以后隨鏈復(fù)制為例，當(dāng)RNA引物被切除后，岡崎片段之間是由DNA聚合酶 I催化合成的DNA填補(bǔ)之，然后再由DNA連接酶將它們連接成一條完整的鏈。但是DNA聚合酶 I 催化合成DNA時(shí)，需要自由3’—OH作為引物，最后余下子鏈的5’無(wú)法填補(bǔ)，于是染色體就短了一點(diǎn)。
在正常體細(xì)胞中普遍存在著染色體酶復(fù)制一次端粒就短一次的現(xiàn)象。人們推測(cè)，可能一旦端?？s短到某一閾限長(zhǎng)度一下時(shí)，他們就會(huì)發(fā)出一個(gè)警報(bào)，指令細(xì)胞進(jìn)入衰老；或許是當(dāng)細(xì)胞判斷出它們的染色體已變得太短了，于是分裂也就停止了，造成正常體細(xì)胞壽命有一定界限。但是在癌細(xì)胞中染色體端粒卻一直維持在一定長(zhǎng)度上，這是為什么？這是因?yàn)镈NA復(fù)制后，把染色體末端短缺部分補(bǔ)上需要端粒酶，這是一種含有RNA的酶，它既解決了模板，又解決了引物的問(wèn)題。在生殖細(xì)胞和85%癌細(xì)胞中都測(cè)出了端粒酶具有活性，但是在正常體細(xì)胞中卻無(wú)活性，20世紀(jì)90年代中期，Blackburn首次在原生動(dòng)物中克隆出端粒酶基因。
端粒酶在癌細(xì)胞中具有活性，它不僅使癌細(xì)胞可以不斷分裂增生，而且它為癌變前的細(xì)胞或已經(jīng)是癌性的細(xì)胞提供了時(shí)間，以積累附加的突變，即等于增加它們復(fù)制，侵入和最終轉(zhuǎn)移的能力。同時(shí)人們也由此萌生了開(kāi)發(fā)以端粒為靶的藥物，即通過(guò)抑制癌細(xì)胞中端粒酶活性而達(dá)到治療癌癥的目的。
至于真核細(xì)胞DNA末端的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，早就在1978年Blackburn就以原生動(dòng)物四膜蟲(chóng)（一種纖毛蟲(chóng)）為例說(shuō)明之：① 迥紋形式的發(fā)夾環(huán)；② 僅由C,A組成的簡(jiǎn)單序列大量重復(fù)（C4A2）20~70；③ 鏈上有許多缺口（nicks）。
參考資料
[1]
DNA Replication · allaboutscience[引用日期2013-04-02]
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