精選百科
本文由作者推薦
轉(zhuǎn)染
真核細(xì)胞導(dǎo)入外源DNA的過程
轉(zhuǎn)染(transfection)是真核細(xì)胞主動或被動導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新的表型的過程。從本質(zhì)上講，和轉(zhuǎn)化沒有根本的區(qū)別。無論是轉(zhuǎn)染還是轉(zhuǎn)化，其關(guān)鍵因素都是用氯化鈣處理大腸桿菌細(xì)胞，以提高細(xì)胞膜的通透性，從而使外源DNA分子能夠容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。所以在習(xí)慣上，人們往往也通稱轉(zhuǎn)染為廣義的轉(zhuǎn)化。常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（永久轉(zhuǎn)染）兩大類。
基本信息
| 中文名 | 轉(zhuǎn)染 |
| 外文名 | transfection |
| 分類 | 瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 |
| 學(xué)科 | 生物學(xué) |
簡介
細(xì)胞化學(xué)轉(zhuǎn)染
常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類，一類是瞬時轉(zhuǎn)染，一類是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（永久轉(zhuǎn)染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細(xì)胞中可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動子和其它調(diào)控元件的分析。一般來說，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72小時內(nèi)（依賴于各種不同的構(gòu)建）分析結(jié)果，常常用到一些報告系統(tǒng)如熒光蛋白，β半乳糖苷酶等來幫助檢測。后者也稱穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在。盡管線性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入量低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過一些選擇性標(biāo)記，如來氨丙基轉(zhuǎn)移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。
轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大，許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例，細(xì)胞數(shù)量，培養(yǎng)及檢測時間等。
分類
化學(xué)
包括：
1.DEAE-葡聚糖法
轉(zhuǎn)染示意圖
2.磷酸鈣法
磷酸鈣法是磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法，因為試劑易取得，價格便宜而被廣泛用于瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的研究，先將DNA和氯化鈣混合，然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉淀，最后把含有沉淀的混懸液加到培養(yǎng)的細(xì)胞上，通過細(xì)胞胞膜的內(nèi)吞作用攝入DNA。磷酸鈣似乎還通過抑制血清中和細(xì)胞內(nèi)的核酸酶活性而保護(hù)外源DNA免受降解.
3.人工脂質(zhì)體法。
人工脂質(zhì)體法采用陽離子脂質(zhì)體，具有較高的轉(zhuǎn)染效率，不但可以轉(zhuǎn)染其他化學(xué)方法不易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，而且還能轉(zhuǎn)染從寡核苷酸到人工酵母染色體不同長度的DNA，以及RNA,和蛋白質(zhì)。此外，脂質(zhì)體體外轉(zhuǎn)染同時適用于瞬時表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)，與以往不同的是脂質(zhì)體還可以介導(dǎo)DNA和RNA轉(zhuǎn)入動物和人的體內(nèi)用于基因治療。LipoFiter 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(LipoFiterLiposomalTransfectionReagent)是一種適合于把質(zhì)粒或其它形式的核酸，以及核酸蛋白復(fù)合物轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的真核細(xì)胞中的高效陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑。它可以和帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合后形成復(fù)合物，當(dāng)復(fù)合物接近細(xì)胞膜時被內(nèi)吞成為內(nèi)體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，隨后DNA復(fù)合物被釋放進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，至于DNA是如何穿過核膜的，其機(jī)理目前還不十分清楚。
物理
包括：①顯微注射②電穿孔③基因槍等，顯微注射雖然費力，但是非常有效的將核酸導(dǎo)入細(xì)胞或細(xì)胞核的方法。這種方法常用來制備轉(zhuǎn)基因動物，但卻不適用于需要大量轉(zhuǎn)染細(xì)胞的研究。電穿孔法常用來轉(zhuǎn)染如植物原生質(zhì)體這樣的常規(guī)方法不容易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。電穿孔靠脈沖電流在細(xì)胞膜上打孔而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。導(dǎo)入的效率與脈沖的強度和持續(xù)時間有關(guān)系，基因槍依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，這種方法適用于培養(yǎng)的細(xì)胞核在體的細(xì)胞。
實驗
細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗
目的
基因轉(zhuǎn)染示意圖
原理
外源基因進(jìn)入細(xì)胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法。電擊法是在細(xì)胞上短時間暫時性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入；磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進(jìn)入細(xì)胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染細(xì)胞的方法使得其進(jìn)入細(xì)胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實驗條件控制較嚴(yán)、難度較大；病毒法的前期準(zhǔn)備較復(fù)雜、而且可能對于細(xì)胞有較大影響；所以現(xiàn)在對于很多普通細(xì)胞系，一般的瞬時轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法。
利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法最重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時間長短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問題，通過實驗摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對于效率的提高有巨大的作用。
材料器材
（1）材料
293T細(xì)胞、MyoD表達(dá)質(zhì)粒和EGFP表達(dá)質(zhì)粒、DMEM培養(yǎng)基、鏈霉素/青霉素（雙抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸鹽緩沖溶液）、胰酶/EDTA消化液、轉(zhuǎn)染試劑（TransFast）
（2）器材
步驟
細(xì)胞傳代
(2)棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。
(4)加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。
(5)用Tip頭多次吹吸，使細(xì)胞完全分散開。
(6)將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。
(7)用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)后選擇0.8X10 個細(xì)胞加入一個35mm培養(yǎng)皿。
(9)將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)染。
1）轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備
B.震蕩后將試劑放在－20攝氏度保存，使用前還需震蕩。
2）選擇合適的混合比例（1：1－1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量）來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。
5）將混合液在室溫放置10—15分鐘。
6)吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。
7）加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個小時。
第二次細(xì)胞傳代
3）在正常條件下培養(yǎng)24小時后按照染色要求條件固定。
篩選
轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選
不同的細(xì)胞株對各種抗生素有不同的敏感性，因此在篩選前要做預(yù)試驗，確定抗生素對所選擇細(xì)胞的最低作用濃度。
1) 提前24 小時在96 孔板或24 孔板中接種細(xì)胞8 孔，接種量以第二天長成25%單層為宜，置CO2 孵箱中37℃培養(yǎng)過夜。
2) 將培養(yǎng)液換成含抗生素的培養(yǎng)基，抗生素濃度按梯度遞增（0, 50, 100, 200,400, 600, 800 和1000μg/ml）。
3) 培養(yǎng)10-14 天以絕大部分細(xì)胞死亡濃度為準(zhǔn)，一般為400-800μg/ml,篩選穩(wěn)定表達(dá)克隆時可比該濃度適當(dāng)提高一個級別維持時使用篩選濃度的一半.
2．轉(zhuǎn)染按前面的步驟進(jìn)行。
3．轉(zhuǎn)染72 小時后按1:10 的比例將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在6 孔板中傳代，換為含預(yù)試驗中確定的抗生素濃度的選擇培養(yǎng)基。在6 孔板內(nèi)可見單個細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)可見單個細(xì)胞分裂繁殖形成單個抗性集落，此時可用兩種方法挑選單克隆。
1) 濾紙片法：用消毒的5x5mm 濾紙片浸過胰酶，將濾紙片貼在單細(xì)胞集落上10-15 秒，取出粘附有細(xì)胞的濾紙片放于24 孔板中繼續(xù)加壓培養(yǎng)。細(xì)胞在24 孔板中長滿后轉(zhuǎn)入25cm 培養(yǎng)瓶中，長滿后再轉(zhuǎn)入75cm 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
2) 有限稀釋法：將細(xì)胞消化下來后做連續(xù)的10 倍稀釋（10-2—10-10），將每一稀釋度的細(xì)胞滴加到96 孔板中培養(yǎng)，7-10 天后，選擇單個克隆生長的孔再一次進(jìn)行克隆。
4. ELISA 或Western blot 檢測單克隆細(xì)胞中外源蛋白的表達(dá)情況由于不同克隆的表達(dá)水平存在差異因此可同時挑選多個克隆選擇表達(dá)量最高的克隆傳代并保種。
研究進(jìn)展
轉(zhuǎn)染技術(shù)
轉(zhuǎn)染試劑
轉(zhuǎn)染效率
線型PEI（LinePEI,LPEI）與其衍生物用作基因轉(zhuǎn)染載體的研究比分枝狀PEI（BranchedPEI,BPEI）要早一些，過去的研究認(rèn)為在不考慮具體條件，LPEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞毒性較低，有利于細(xì)胞定位，因此與BPEI相比應(yīng)該轉(zhuǎn)染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，從而提高轉(zhuǎn)染效率，但同時細(xì)胞毒性也增大。超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基，在染實驗中發(fā)現(xiàn)這種PEI的毒性低，但轉(zhuǎn)染效率卻較高。
有的產(chǎn)品采用各種分枝狀和超高分枝狀的小分子PEI與各種含有生理條件下可降解鍵的交聯(lián)劑交聯(lián)，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝結(jié)構(gòu)使得其具有較高的正電性，因此易于高效地包裹各種DNA、RNA分子及質(zhì)粒形成小的納米顆粒，從而提高轉(zhuǎn)染效率，當(dāng)所形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞以后，其中所含的生理條件下可降解的化學(xué)鍵在細(xì)胞內(nèi)水解，使交聯(lián)聚合物分解為無細(xì)胞毒性的小分子PEI，這樣結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)染試劑在體外應(yīng)用可以獲得高的轉(zhuǎn)染效率和低的細(xì)胞毒性，其可降解性對體內(nèi)應(yīng)用也具有重要的意義。
現(xiàn)在最新的轉(zhuǎn)染試劑是采用納米材料制作，如Engreen，其原理是：分子內(nèi)含有許多氨基，在生理PH下會發(fā)生質(zhì)子化，這些質(zhì)子化的氨基可以中和DNA質(zhì)粒表面的負(fù)電荷，使DNA分子由伸展結(jié)構(gòu)壓縮為體積相對較小的DNA粒子，并包裹在其中，使DNA免受核酸酶的降解。轉(zhuǎn)染復(fù)合物主要是通過細(xì)胞內(nèi)吞作用將DNA轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞，形成內(nèi)含體(endosome)，DNA從內(nèi)含體釋放，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，再進(jìn)一步進(jìn)入核內(nèi)轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。通過納米技術(shù)生產(chǎn)出的轉(zhuǎn)染試劑在納米尺度表現(xiàn)出結(jié)合保護(hù)DNA能力強、毒性低的獨特性能。
轉(zhuǎn)染相關(guān)的文章
法魯克一世（拉丁文轉(zhuǎn)寫：Fārūq），全名穆罕默德·法魯克（Muhammad Fārūq），第二任埃及和蘇丹國王，努比亞、科爾多凡和達(dá)爾富爾的統(tǒng)治者（1936年至1952年在任）。
cairoCairo是一個2D圖形庫，支持多種輸出設(shè)備?；拘畔⑼馕拿鹀airo主要優(yōu)點方便頁面的再次利用目的同時能利用硬件加速器作用支持多種輸出設(shè)備詳細(xì)介紹目前支持的輸出目標(biāo)包括XWindow，Quartz，Win32，image.buffers，PostS
埃及鎊是埃及的官方貨幣，其紙幣單位為埃及鎊，輔幣單位為皮阿斯特。1埃及鎊可以兌換0.383至0.4326元人民幣，硬幣種類有1、5、10的皮阿斯特，紙幣有分5、10、25、50的皮阿斯特及1、5、10、20、50、100的埃及鎊。1鎊等于100皮亞斯特或1000米利姆。自2022年7月6日起，新的1
亞得里亞海，意大利語作Mare Adriatico，英語作Adriatic sea。地中海的一個大海灣。長約800公里(500哩)，平均寬160公里(100哩)，平均水深444公尺(1,457呎)，最深處1,324公尺(4,035呎)，面積131,050平方公里(50,590平方哩)。北淺、南深，平
蕈（拼音：xùn）樹（學(xué)名：Altingia chinensis (Champ. ex Benth.) Oliv. ex Hance）為蕈樹科（Altingiaceae）蕈樹屬（Altingia）常綠喬木，別名山鋰枝、阿丁楓等。蕈樹原產(chǎn)于中國長江流域以南的各地，越南也有分布，多生長在海拔400-16
南歐歐洲南部的簡稱南歐（southern Europe）是歐洲南部的簡稱，范圍包括伊比利亞半島、亞平寧半島及巴爾干半島南部，包括西班牙、葡萄牙、安道爾、意大利、希臘、馬耳他、梵蒂岡、圣馬力諾、斯洛文尼亞、克羅地亞、阿爾巴尼亞、羅馬尼亞、保加利亞、塞爾維亞、黑山、馬其頓和波斯尼亞和黑塞哥維那共17個國家，也稱為地中海歐洲，因為大多南歐國家靠近地中海。面積約為166萬多平方公里。南歐隔著地中海與亞、非
尚可名片
這家伙太懶了，什么都沒寫！
作者
